草坪型黑麦草高效遗传转化体系的建立及耐逆基因工程

作者 宋贺玲
本研究目的在于建立草坪型黑麦草的高效遗传转化体系,培育耐逆的新型黑麦草。首先,优化多年生黑麦草商业品种的再生体系,主要从生长素2,4-D和细胞分裂素BAP的组合,提高培养基渗透势,添加有机物肌醇、有效增加胚性愈伤生长量和保持长时间的胚性能力等角度展开。结果表明,从成熟胚诱导胚性愈伤组织过程中,采用MS+3mg/L 2,4-D+0.1mg/L BAP+0.5g/L肌醇+0.5g/L水解酪蛋白+2g/LGelrite+30g/L蔗糖为基本培养基,对于诱导愈伤组织、抑制成熟胚提前萌发是最适合的培养条件;通过对胚性愈伤在MS+3mg/L 2,4-D+0.1mg/LBAP+2.5g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+3g/LGelrite+30g/L蔗糖的培养基上继代改造,使胚性愈伤富集,并作为遗传转化的起始材料;相对以液体培养方式增加胚性愈伤生长量而言,固体培养基上连续继代的方式,使遗传转化程序上更简便,且减少白化苗频率。

为获得耐逆的新型黑麦草,我们采用基因枪法和农杆菌LBA4404介导方式,向多年生黑麦草中导入一个来源于拟南芥HS基因家族中的成员——HS1基因。对转基因植株进行分子鉴定和除草剂Basta抗性实验,结果表明有六株转基因再生苗,其中五株是通过农杆菌介导转化后获得的。六个转基因株系中以T5在表型上与非转基因植株比较差异比较明显,T5分蘖粗壮、分蘖性强,根部发达,根系粗且长。对部分转基因植株做抗旱处理,从处理后的表型上看,T2和T3有一定的耐旱能力,T2好于T3;T1和非转基因植株比较没有明显差异。200mMNacl处理T2、T3和T5转基因植株,三个转基因株系都能耐受盐胁迫,在盐胁迫条件下根系生长良好,其中以T5差异最为显著。分析转基因植株在干旱和盐胁迫下的脯氨酸含量、MDA累积、SOD和CAT的酶活,结果表明,耐旱的转基因株系相对于非转基因植株,有较低水平的脯氨酸和MDA累积,较高水平的SOD和CAT酶活;非转基因植株中有较高水平的脯氨酸和MDA,较低水平的SOD和CAT酶活,并且酶活趋势上呈急剧的单峰曲线,而T2、T3和T5中都酶活力持续时间长,在一定时期内能稳定的清除胁迫后的自由基和过氧化氢。因此,我们认为来源于拟南芥的HS1基因在黑麦草中同样具备抗旱耐盐的生理功能,是一个适合用做抗旱耐盐遗传改良的重要基因。

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